Aide de cours en biochimie des protéines

Cette page est expérimentale, son but est de vous faire travailler pas à pas en ayant un accès direct aux ressources de wikipedia et d'autres sites spécialisés ; et en vous permettant de faire des exercices et de rédiger des fiches de synthèse. Merci de vos retours et conseils sur le fond (erreurs à corriger) ou la forme (améliorer l'ergonomie, la lisibilité ...) ; je ferai ce que je peux ! 😉 J.D.

La chromatographie d'échange d'ion (IEX)

Principes théoriques

Principes théoriques

Rappel sur la charge des protéines

Les protéines sont constituées des 20 acides aminés assemblés par le ribosome lors de la traduction et de quelques acides aminés dérivés des 20 premiers par modification post-traductionnelle (hydroxy-proline, hydroxy-lysine, ...).
Certains ont des chaînes latérales hydrophobes, d'autres hydrophiles, et parmi ces derniers, certains ont des chaînes latérales partiellement ionisées, donc chargées

Quels sont les acides aminés chargés ?
Chaîne latérale chargée ?






Sources wiki :

Rappels sur la force des acides et des bases : phases fixes chargées

Définition d'un acide : molécule capable de fournir un ou plusieurs protons (H+) à une base ;

remarques : :

  • pour une base, c'est l'inverse !
  • les groupements chimiques échangeurs d'ions sont très souvent des acides ou des bases ou leurs sels …
  • H2O est à la fois un acide et une base ;

    écrire les deux équations ;

    Proposition de réponse
    acide : H2O ⇆ H+ + HO-
    wiki sur les acides
    base  : H2O + H+ ⇆ H3O+
    wiki sur les bases

Acides et bases fortes

AHn → An- + n.H+
de même
BOH → Bn+ + n.OH-

  • Les acides forts sont par exemple les acides chlorhydrique (HCl), sulfurique (H2SO4) qui sont entièrement ionisés dans l'eau et donnent respectivement : une mole de protons (hydronium = proton + H2O = H3O+)

    par mole d'HCl ; et deux moles pour l'acide sulfurique.
    Leur réaction est brutale, totale et irréversible lorsqu'ils sont dissouts dans l'eau (attention les projections !) ; autrement dit, un acide fort donne tous ses protons à l'eau accompagné d'un ion spectateur stable (pour nos deux acides ce sera le chlore et le sulfate). Un acide ou une base forte ont dans leur équation réactionnelle une flèche à sens unique !

  • Les bases fortes utilisées en biologie sont souvent des oxydes de métaux alcalins :

    • CaO (chaux vive) qui donne après hydratation la chaux éteinte Ca(OH)2 ; elle n'est utilisée que pour mettre en évidence le gaz carbonique dans l'air …
    • la potasse ou KOH est utilisée pour saponifier les corps gras de type diacyl (phospholipides) ou triacyl glycérol (les triglycérides : huiles et graisses alimentaires) ;
    • c'est surtout la soude NaOH qui est la plus utilisée pour alcaliniser les milieux de culture et pour ajuster le pH des tampons.

Acides et bases faibles

Les acides et bases faibles sont des molécules dont l'acidité ou l'alcalinité n'est pas complète : dans l'eau elles sont sous forme d'un mélange entre leur forme acide et leur forme basique

La formule du pKa permet de le montrer

Le pKa est un pH particulier à chaque acide ou base organique qui exprime le pH pour lequel il y a autant de formes acides (AH ou BH+) que de forme basique (A- ou B).

En biologie, la plupart des acides faibles contiennent des groupements carboxyliques (-COOH) ou phosphoriques (-o-P(OH)2) et les bases sont essentiellement des composés de l'azote (-NH2).

Mise en oeuvre technologique

Mise en oeuvre technologique

Les différentes résines échangeuses d'ions

Les échangeuses d'anions

Les échangeuses d'anions fortes

Elles sont dotées de groupements chimiques stables dont la charge + ne varie pas en fonction du pH ; la plus commune est de type Q (pour Ammonium Quaternaire) ; en effet un ammonium quaternaire n'est lié directement à aucun proton échangeable, ses quatres partenaires sont souvent organiques ; par exemple : (CH<sub>3</sub>)<sub>3</sub>-N<sup>+</sup>-(CH<sub>2</sub>)<sub>n fois</sub>

Les résines Q sont utilisées par exemple pour purifier l'ADN, l'ARN et les protéines acides ; l'élution se fait préférentiellement par compétition.

Proposer une composition de tampon d'élution dans ce cas.

proposition de réponse L'élution se fait avec un tampon riche en cathions (NaCl concentré tout simplement).
Les échangeuses d'anions faibles

Ce sont des amines primaire, secondaire ou tertiaires, donc des acides faibles. Par conséquent leur charge varie en fonction du pH et donc leur capacité de rétention.

Est-ce que leur capacité de rétention augmente si le pH augmente ?

Proposition de réponse

NON ! : à pH très acide la charge des bases faible est maximale car elles sont majoritairement sous leur forme ammonium positif ; donc quand le pH augmente, leur charge diminue et leur capacité d'échange aussi !

Une des résines de ce type les plus utilisées, est le DEAE cellulose résine DEAE cellulose

Le DEAE est il un ammonium primaire, secondaire ou tertiaire ?

Réponse

Tertiaire puisqu'il y a trois molécules organiques liées à l'azote.

Les échangeuses de cathions

Ce sont des résines (polymères) chargées négativement.

Les échangeuses de cathions fortes

Pour la plupart elles sont contiennent des groupements sulfates (ion spectateur de l'acide fort sulfurique), dont la charge est permanente et ne dépend pas du pH !

Les échangeuses de cathions faibles

Ces résines sont souvent constituées de groupements acides carboxyliques liés covalemment à une résine : carboxy-méthyl cellulose par exemple.

point isolélectrique

Sources sur le net :

Mise en pratique : technologie

L'échange d'anions

L'échange de cathions

TD de biochimie / bioinformatique : prévoir un pHi

Pour purifier une protéine connue par chromatographie d'échange d'ions, il est préférable de faire en sorte qu'elle fasse partie des protéines retenues sur la phase fixe ; pour cela il faut que le tampon soit à un pH déterminé par la charge nette de la protéine, la charge de la phase fixe

Le lien suivant (cliquer ici ) vous amènera sur la page d'un site qui permet de calculer le pHi probable d'une protéine en fonction de sa séquence en acides aminés.

questions préliminaires

Q1 : sous quel format bioinformatique doit-on indiquer la séquence en acides aminés ?

Proposition de réponse

Le format FASTA permet de présenter une séquence d'acides nucléiques (ARN ou ADN) ou une séquence protéique sous forme compacte à l'aide d'un code à une lettre ; un format FASTA présente seulement deux lignes : - la première qui commence par le symbole inférieur "<" suivi la plupart du temps d'informations minimales dont le numéro d'accession (numéro d'ordre) ou Accession number en anglais

; et la seconde qui est la séquence orientée in extenso : les acides nucléiques vont de 5' en haut à gauche vers 3' en bas à droite (sens de la réplication de l'ADN, et de la synthèse des ARN ...) ; les protéines de l'acide aminé NH2 terminal (souvent la méthionine !) à gauche vers l'acide aminé COOH terminal (le dernier ajouté par le ribosome pendant la synthèse protéique).

Q2 : comment et où trouver les séquences de protéines ?

Proposition de réponse

Les séquence de protéines sont accessibles dans des bases de données spécialisées via un portail de bioinformatique. Le portail (gate en anglais) le plus connu et utilisé est le site ncbi qui est un moteur de recherche spécialisé dans les données biologiques.

Q3 : décrire comment rechercher la séquence FASTA de l'albumine bovine (bos taurus) et celles du lysozyme et de l'ovalbumine de l'oeuf de poule (rechercher le nom scientifique sur wiki ; les protéines sont écrites en englais sans e à la fin du mot : ovalbumin)

Proposition de réponse
  1. aller sur la page principale de ncbi ;
  2. dans la liste déroulante All Databases sélectionner l'item Protein ;
  3. dans la barre de requète (avant le bouton search ), taper les mots clefs suivant : "bos taurus albumin" , puis cliquer sur Search qui lance la requète (pose la question au serveur) ;
  4. cliquer sur le lien "FASTA" de la première et bonne réponse : alumin [bos Taurus] 607 aa ; accession : AAA51411.1 ; enregistrer cette séquence au format FASTA dans bloc note pour plus tard ;
  5. faire de même pour le lysozyme du blanc d'oeuf de poule ;
  6. on trouve par exemple : lysozyme [Gallus gallus] 147 aa protein Accession: ACL81750.1 : 
    >ACL81750.1 lysozyme [Gallus gallus]
MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTD
SGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQA
WIRGCRL
####################################################################### site pour calculer le pHi : cliquer ici

Q4 : chercher et stocker les séquences au format FASTA des protéines :
albumine humaine, albumine de boeuf, lysozyme

Proposition de réponse

Q5 : prédire le pHi du lysozyme et de l'ovalbumine à l’aide du logiciel en ligne suivant : cliquer ici ; quel sont les pHi ?
Ces pHi sont-ils cohérents avec les résultats obtenu en TP ?

Proposition de réponse
paramètres \ protéinesovalbumine lysozyme
pHi 5,09 8,37
nombre de charges à pH = 7,4 (cytoplasme) -14,8 + 5,2
nombre d'aa acides (Asp, Glu) 14 et 33 7, 2
% d'aa acides sur total 47 / 386 = 12,2 % 9 / 147 = 6,1 %
nombre d'aa basiques (lys, arg, his) 42 / 386 = 10,9 % 19 / 147 = 13 % deux fois plus que d'acides !
Concusion : protéine acide donc négative aux pH usuels
donc c'est cohérent aec le fait que l'ovalbumine sorte au volume mort avec les autres protéines non retenues par le support échangeur de cations		 protéine basique donc positive aux pH utilisés
donc c'est cohérent avec le fait expérimental qui montre que cette protéine est retenue par la phase stationnaire négative (sulfate). 
>AAA51411.1 albumin [Bos taurus] 607 aa
MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNEL
TEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLK
PDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMRE
KVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDR
ADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFL
GSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK
LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKT
PVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKP
KATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA

>AAA98797.1 albumin [Homo sapiens]
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEV
TEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLV
RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELR
DEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADD
RADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVF
LGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE
QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEK
TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHK
PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

>AAB59956.1 ovalbumin [Gallus gallus]
MGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSI
EAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAAD
QARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVFKGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQ
MMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIK
VYLPRMKMEEKYNLTSVLMAMGITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGV
DAASVSEEFRADHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP

>ACL81750.1 lysozyme [Gallus gallus]
MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTD
SGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQA
WIRGCRL

Sources sur le net :